株式会社バイオロジカ: 4月 2017

抗体のシーケンシング

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Creative Biolabsによるde novo抗体シークエンシングのサービスを提供致します。同社独自の技術であるDatabase Assisted Shotgun Sequencing (DASS)により実現しました。

あらゆる種、アイソタイプ、アロタイプの抗体の重鎖・軽鎖全体、可変部にわたるシーケンシングが可能です。

多価の精製モノクローナル抗体は、所望の領域の100％の配列決定することができます。同社が成功した数多くの事例から、抗体のシーケンスを100％の精度で提供。

DASS systemにより、

Confirmation & validation of produced mAb
QC analysis
IND (Investigational New Drug)・NDA (New Drug Application)

計測機器

高磁場Orbitrap EliteハイブリッドMS（Thermo Scientific）[240,000の分解能と1ppm未満の分析精度]を使用。
フラグメンテーション手法は、CID ( Collision Induced Dissociation)、HCD (Higher energy collision dissociation)、およびETD (Electron Transfer Dissociation)。
これらの技術を組み合わせて使用することで、最高のカバレッジを確保できます。

Sequence Validation Guarantee

お急ぎの皆様のために、確実・迅速に配列検証を行います。

還元された軽鎖および重鎖の質量が測定されます。軽鎖の配列は、±1.2Daの範囲内で一致し、重鎖については、±1.8Daが許容されます。決定された配列がタンパク質質量と一致しない場合、請求はされません（この偏差はプロトン2つよりも小さいことに注意してください）。
抗体の各突然変異は、少なくとも2つの有意なスペクトルによって確認されます。これにより、シーケンスで同重の置換が含まれないことが保証されます。ペプチドマップだけに依存しないでください。[同重の置換とは、GG = N、YM = FM（Ox）のように同じ質量の交換のことです。他社が使用しているペプチドマップは、この種のエラーに敏感でないことがよくあります。]

Sequencing of the V and J and C Segments by DASS

抗体のVおよびJおよびC遺伝子セグメントは、公開データベースで入手可能ですが、抗体の成熟の間、B細胞は、親和性を最適化するために、超変異を配列に導入します。同社のマッピングアルゴリズムはエラー耐性があり、"変異した"ペプチドを、対応する生殖系列に確実にマッチさせることができます。

ペプチドの数が多いため、抗体中のすべてのペプチド結合の配列情報が得られます。典型的には、各アミノ酸（AA）位置に対して20〜70の異なるMS / MSスペクトルが生成されるため、プロリンおよびアルギニンリッチなペプチドの最も難しい配列さえも解明することができます。すべてのアミノ酸の順序が明確であるため、エドマン法のような時間のかかる技術は必要ありません。

**CDR3領域のDe Novo シークエンシング**

軽鎖のCDR3はほとんどが生殖系列の配列によってコードされておりますが、重鎖のCDR3は通常データベースには存在しません。いわゆるDセグメントによってコードされるが、これらはヌクレアーゼおよび末端トランスフェラーゼによって修飾されます。典型的には、Dセグメントのわずか1〜4アミノ酸が成熟抗体に残り、Dセグメントの残りの部分は「人工的」であり、新たにシーケンスされなければなりません。

同社の方法は、断片化プロセス中に多数の重複ペプチドを生成し、非常に長い未知のアミノ酸配列の読み取りを可能にします。インテリジェントなデータマイニングと組み合わせた高品質のMS / MSスペクトルは、本のようにCDR3を読むことができます。この技術は非常に強力で、20 kDaのタンパク質を配列決定することができました。このタンパク質は、データベースに相同体がありませんでした。

Isobaric Amino Acids

他のMSを基にした方法とは対照的に、同社はほとんどの同重体アミノ酸の組み合わせを識別することが可能です。例えば：

W(Trp)は質量精度でGE(Gly-Glu)、AD(Ala-Asp)、SV(Ser-Val)と区別できます。
R(Arg)は質量精度でGV(Gly-Val)と区別できます。
Q(Gln)は質量精度でK(Lys)と区別できます。
N(Asn)はGG(Gly-Gly)と区別できます。同社のDASS技術は、GG間の結合破壊を保証し、アスパラギンに独自の誘導体化技術を使用してGGでないことを確認しています。
Q(Gln)はGA(Gly-Ala)と区別できます。同じく、GA間の結合破壊を保証し、GGでないことを保証するために、当社独自の誘導体化技術をグルタミンに使用しています。
キモトリプシンの生殖系列配列および切断頻度からロイシンが予測されます。

Sequencing of Fluorochrome mAbs, IgMs, and other Non-Standard Antibodies

少量のサンプル（例：20μg）から約90％の確率で配列を得ることができます。
配列決定のために非常に希釈したサンプル（例：ウェスタンブロット抗体）も濃縮できます。
通常、抗体に結合したリガンド（FITC、Biotin、Alexa）の影響を受けません。より大きいタンパク質リガンド（PE、APC）は、配列決定をやや困難にしますが、シークエンシングの質はサンプル量に依存するため、これはより高いタンパク質濃度にすることによって補うことができます。
通常、IgMはIgGのように配列決定することができます。やや多めのサンプルが必要な場合があります。定常領域はPNGase Fで切断できないいくつかのグリカンによって修飾されているため、抗体の可変部分のみの保証となります。
すべての種（マウス、ラット、ハムスター、ラマ、ウサギなど; Fab、scFvなど）のすべての抗体フォーマットで機能します。
いくつかのmAbはマトリックスにカップリングされます。これはシーケンシング法と互換性がありますが、より多くのサンプルが必要になることがあります。
多くの古いハイブリドーマは、2つの軽鎖を産生します（1つは骨髄腫MOPC 21のκ鎖）。これらの混合物は、MOPC 21κ鎖が2倍モルの過剰であっても、通常は配列決定することができます。

Sample Sequencing Results.

Other Features

Fast: シーケンス作業は10営業日以内に完了。
Sensitive: 50-100μgのタンパク質から完全なカバレッジ。
Robust: VJおよびVDJ領域の100％カバレッジ。
High-Throughput: 同社のDASS方式は、ハイスループット。
Professional: 経験豊富なPh.D.の科学者。高度な品質でデータを配信するためのプロトコル。
Integrity: 抗体設計、クローニング、デノボシークエンシングと分析、お客様のニーズを満たすためのインビトロ最適化などのカスタムサービス。

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2017年4月26日水曜日

オリゴDNA合成

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関連製品

2017年4月20日木曜日

De Novo Antibody Sequencing Services